In situ hybridisering

De in situ hybridisering er en metode for å oppdage kromosomavvik. Visse kromosomer er merket med fluorescerende fargestoffer og bundet til en DNA-sonde. Denne teknikken brukes til prenatal diagnose av genmutasjoner.

Hva er hybridisering in situ?

Ved hybridisering in situ eller Fluorescens in situ hybridisering nukleinsyrer fra RNA eller DNA blir påvist i visse vev eller i en celle ved bruk av molekylærgenetiske metoder. Vanligvis brukes denne typen diagnoser for å oppdage en strukturell eller numerisk kromosomavvik under graviditet.

For dette formålet brukes en kunstig produsert sonde, som i seg selv består av nukleinsyre. Den binder seg deretter til nukleinsyrene i organismen gjennom baseparring. Denne bindingen menes med begrepet hybridisering. Bevis er basert på livets struktur for pasienten og tilsvarer derfor bevis på stedet. Dette skal skilles fra in vitro-metoder der deteksjonen foregår i reagensglasset. Metoden ble utviklet på 1900-tallet av forskere Joe Gall og Mary Lou Pardue.

Teknologi har utviklet seg siden den gang. Mens radioaktive sonder ble brukt på den tiden, for eksempel, brukes fluorescensmerkede sonder med en kovalent binding til markørmolekylene i dag.

Funksjon, effekt og mål

Hybridisering in situ brukes vanligvis for å påvise kromosomavvik, dvs. kromosomale anomalier som ikke kan påvises i et karyogram. Dette betyr at metoden alltid brukes når arvelige sykdommer skal bestemmes under graviditet.

Siden kromosomavvik er et problem som ikke bør undervurderes i dag, har bruken av metoden økt over tid. Hybridisering skjer ved hjelp av innfødte celler fra mors fostervann. Grunnlaget for teknologien er bindingen av den fargemerkede sonden til DNA-deler. Takket være bindingen kan antall kopier senere evalueres med et mikroskop, siden de enkelte kopiene avgir et lyssignal og dermed kan bli synliggjort under mikroskopet. Det er forskjellige prosedyrer. Enten skjer analysen umiddelbart etter binding.

I dette tilfellet brukes et fluorescerende fargestoff som biotin, som er bundet direkte til DNA-sonden. Med den indirekte metoden for in situ-hybridisering kan evalueringen ikke finne sted umiddelbart etter hybridiseringen, siden fluorescerende stoffer bare kan binde seg til sonden etter hybridiseringen. Denne indirekte metoden brukes oftere enn den direkte fordi den antas å være mer følsom. I tillegg til kromosomspesifikke sentrometer-DNA-prober, er det også lokusspesifikke DNA-prober, kromosomspesifikke DNA-biblioteksonder og sammenlignende genomhybridiseringer.

Kromosomspesifikke sentrometer-DNA-prober kan brukes til å oppdage kromosomalt numeriske avvik. Dette betyr at de hovedsakelig brukes når det er mistanke om dupliserte eller slettede kromosomer. De stedsspesifikke DNA-probene er spesielt egnet for påvisning av minimale mutasjoner som ikke kan påvises i karyogrammet. En kromosomspesifikk DNA-bibliotekssonde brukes spesielt for å oppdage innsettinger og translokasjoner.

Sammenlignende genomhybridisering er derimot en omfattende analyse av tap og gevinster i kromosomalt materiale. I dag er in-situ hybridisering veldig viktig i diagnosen av forskjellige kromosommutasjoner.Ved diagnostisering av Downs syndrom bindes prober for eksempel til kromosom 21. For dette formålet brukes vanligvis kromosomspesifikke sonder som kan brukes hvis denne sykdommen mistenkes.

En mistanke kan for eksempel oppstå hvis foreldrene tidligere har født et barn med sykdommen og ultralydbildet er unormalt. Hvis det er en trippel i stedet for en dobbeltbinding og dermed et trippel fargesignal sendes ut, vurderes diagnosen som bekreftet.

Risiko, bivirkninger og farer

I motsetning til PCR, for eksempel, er hybridisering in situ betydelig mindre utsatt for forurensning. I tillegg er tiden som kreves for prosessen betydelig mindre. Men fordi embryoer spesielt danner kromosommønster, kan et mønster ikke brukes til å bestemme resten av kromosomfordelingen og dermed den genetiske statusen til andre celler.

Fargesignaler kan også overlappe hverandre eller forbli usynlige av andre grunner. Som et resultat er hybridisering in situ som et diagnostisk verktøy under graviditet relativt utsatt for feil. Feildiagnoser kan oppstå, og foreldre kan bestemme seg for et sunt embryo. For å redusere mottakeligheten for feil ved hybridisering in situ, bør minst to embryonale celler undersøkes samtidig. Ved å undersøke to celler parallelt, er det nå bare en ubetydelig risiko for feildiagnostisering.

I et slikt tilfelle kan foreldre absolutt stole på diagnosen. Hybridisering in situ tilbys ikke hver gravid kvinne, men bare til kvinner fra en risikogruppe. Ikke desto mindre nektes ikke gravide kvinner denne typen diagnoser på egen forespørsel. Unormale funn av ultralyd eller unormalt serum kan få en lege til å tilby diagnoseprosedyren. Selv om en stor del, men på ingen måte alle, av kromosomavvik kan diagnostiseres ved anvendelse av in situ hybridisering.

Derfor må hybridisering in situ aldri utføres alene, men må alltid brukes i forbindelse med en konvensjonell kromosomtest. Omsorg for den gravide spiller en viktig rolle i denne prosedyren. Før analysen har mor-til-være derfor en grundig diskusjon om den diagnostiske metoden, som forklarer risikoen, mulighetene og grensene for teknologien.